DNA合成疑难解答

  1.Oligo DNA制品的形态?
  2.如何稀释Oligo DNA制品?
  3.怎样制备100μM的储备液?
  4.Oligo DNA制品如何保存?
  5.Oligo DNA制品在常温下放置了一周还能正常工作吗？
  6.Oligo DNA制品可以用琼脂糖凝胶电泳检测吗？
  7.长度相同、碱基组成不同的Oligo DNA进行变性PAGE电泳时，电泳带应该在同一位置吗？
  8.合成的Oligo DNA多次PCR无目的产物。
  9.琼脂糖凝胶分析PCR产物时观察到非特异条带，为什么？
  10.进行反义DNA（antisense DNA）实验时，对DNA链是采取点硫代还是全程硫代修饰？
  11.PCR产物经克隆后测序发现Oligo DNA处碱基有误，为什么？
  12.能保证合成的Oligo DNA 100%正确吗？
  13.怎样保证合成Oligo DNA的高正确率？
  14.PCR产物可以直接克隆吗？

1.Q: Oligo DNA制品的形态?
A: Oligo DNA制品呈现白色粉末或无色透明均为正常形态。我公司提供的Oligo DNA制品为白色粉末或絮状物，一方面客户能肉眼观察到白色制品，另一方面保证Oligo DNA能即刻溶解。但由于Oligo DNA制品受空气中水份的影响，制品被潮解而吸附于离心管壁或管盖上，呈现无色透明状或难以观察到，遇到这种情况时请在使用前先离心收集Oligo DNA制品于管底，然后溶解Oligo DNA制品。

2.Q: 如何稀释Oligo DNA制品?
A:收到Oligo DNA后，首先请短暂离心，收集Oligo DNA制品于管底，然后慢慢打开管盖，加适量的无菌超纯水或TE缓冲液，盖上管盖，充分上下振荡或用手指弹管底，使Oligo DNA充分溶解。相关的说明及数据请参照我公司的DNA合成报告单。
下面举例说明：
例：您得到一管标为5 OD260的20mer Oligo DNA：
TGG GCG GCG GTT GGT GTT AC
A=1 C=3 G=10 T=6
MW=(1×312)+(3×288)+(10×328)+(6×303)-61=6213
关于分子量，您也可以采用平均分子量的近似算法：
MW=20×324.5=6490
质量数=5×33=165μg
摩尔数=165/6490=0.025μmol=25nmol
若加入250μl超纯水溶解，则浓度为：25nmol/250μl=100μM=100pmol/μl

3.Q: 怎样制备100μM的储备液?
A:体积（μl）=DNA合成报告单上的nmol数目×10

4.Q: Oligo DNA制品如何保存?
A: (1) Oligo DNA干燥制品很稳定，常温下可保存数月，但最好置于-20℃保存。
(2) 溶解后的DNA溶液可于4℃短期保存，长期保存请置于-20℃。在溶解和使用DNA溶液时，请避免核酸酶污染，减少DNA溶液的反复冻融。
(3) 荧光标记Oligo DNA对光敏感，在日光下荧光强度会降低。为了保持荧光标记Oligo DNA的荧光效率，请于-20℃避光保存。Cy3与Cy5在溶液pH>9的条件下会发生分解，所以稀释Cy3与Cy5标记的Oligo DNA时请注意溶液的pH值。

5.Q: Oligo DNA制品在常温下放置了一周还能正常工作吗？
A:Oligo DNA的干燥制品是非常稳定的，即便在溶液中也很稳定。一般情况下，只要没有核酸酶、细菌等的污染，Oligo DNA制品于常温下放置一周仍然能够正常工作，但长期保存请最好置于-20℃。

6.Q: Oligo DNA制品可以用琼脂糖凝胶电泳检测吗？
A:由于化学合成的寡核苷酸所具有的特性，不能使用Agarose Gel及EB染色方法进行质量和浓度检测，必要时请使用变性PAGE电泳检测。主要原因如下：
(1) Oligos是单链DNA，容易形成立体结构。跑琼脂糖凝胶电泳时，容易出现多条带。
(2) Oligos为单链，而EB染色是嵌入到DNA双链的碱基之间。因此，单链DNA形成的立体结构越复杂，EB染色就越容易，DNA条带就越亮。如果单链DNA不形成立体结构，EB就无法染色。

7.Q: 长度相同、碱基组成不同的Oligo DNA进行变性PAGE电泳时，电泳带应该在同一位置吗？
A:对于短链DNA来说，会有差异，但长链DNA差别很小，主要原因如下：
(1) A、G、T、C组成不同，电泳速度不同。
(2) DNA立体结构不同，电泳速度不同。

8.Q: 合成的Oligo DNA多次PCR无目的产物?
A:如果PCR后无目的产物，可以从以下几方面寻找原因：
(1)Oligo DNA设计是否合理。
(2)Oligo DNA和模板是否配对或同源性有多大。
(3)PCR反应试剂是否存在问题：模板DNA、DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、Oligo DNA等。
(4)PCR仪是否正常工作。
(5)退火温度及其它反应条体是否优化。
(6)模板是否存在复杂结构：GC含量高、重复序列等。
影响PCR失败的因素很多，可从多方面分析考虑，若仍然扩增不出带，可要求我公司重新合成Oligo DNA，以排除合成因素的影响。

9.Q: 琼脂糖凝胶分析PCR产物时观察到非特异条带，为什么？
A:

10.Q: 进行反义DNA（antisense DNA）实验时，对DNA链是采取点硫代还是全程硫代修饰？
A:进行硫代磷酸酯寡核苷酸合成时，寡核苷酸间非桥键的等价氧之一被硫所取代，形成了一个手性硫代磷酸二酯，一种体内核酸酶代谢的拮抗剂。特定的片段使特定基因表达中的mRNA转录无效，这种现象被称为“反义效应”。
    为了取得最好的保护效果，许多学者将整条链进行硫代修饰，但这样会使碱基的配对效率降低。因此，通常将片段的两端进行硫代修饰，这样也可取得良好的保护效果，同时又可避免中央片段配对效率的降低。但具体的实验方案须根据您的实验目的及要求决定。

11.Q: PCR产物经克隆后测序发现Oligo DNA处碱基有误，为什么？
A:(1) PCR过程的错配：DNA聚合酶忠实性低、循环数太多、四种dNTP的浓度不同都可能导致在PCR产物序列中Oligo DNA错误。
(2)克隆过程中引起的突变。
(3)测序导致的错误。
(4)合成仪管路的瞬时阻堵，结果引起单个碱基或一部分碱基缺失。
(5)计算机程序失灵导致错误合成。
(6)碱基在偶联到DNA片段之前，碱基与碱基之间发生了偶联，然后再附加到了DNA片段上，导致多碱基现象。
(7)合成过程中出现脱嘌呤，对脱嘌呤后的碱基，DNA聚合酶不能识别，可能导致PCR后出现A或G缺失。
(8)脱保护不完全导致碱基缺失。
(9)Capping反应不完全，截断DNA（n-1）继续参与后续合成，导致缺失碱基。
出现以上情况的概率极低，您可以通过多挑几个克隆得到解决；您也可以通过点突变的方式予以纠正。如果这两种方式您不愿意做，我们公司可以提供免费合成一次。

12.Q: 能保证合成的Oligo DNA 100%正确吗？
A:不能。Oligo DNA的合成是化学反应的过程，由于化学反应的特性，Oligo DNA的纯度不可能是100%，因此多测几个克隆，也许会挑到正确的克隆。

13.Q: 怎样保证合成Oligo DNA的高正确率？
A:(1)选用高纯度Oligo DNA。
(2)选用小于35mer的Oligo DNA。
(3)进行克隆实验时需进行测序验证，尤其进行蛋白表达实验时更须如此。

14.Q: PCR产物可以直接克隆吗？
A:PCR用Oligo DNA的5’端为-OH，因此扩增后的PCR产物5’端也没有磷酸基团。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时，无法克隆进去；而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时，背景会极高。建议对PCR用Oligo DNA的5’端进行磷酸化修饰或对PCR产物的5’端进行磷酸化处理。